HR8262-200T 细胞耗氧率检测试剂盒

细胞氧气消耗检测试剂盒可以用于直接,实时分析细胞呼吸和线粒体功能。本试剂盒可以用来测量各种全细胞（贴壁和悬浮细胞）,透化细胞,各种3D培养物,组织,小生物,球体,支架和基质等。还适用于分离的线粒体,分离的酶,细菌,酵母和霉菌等的细胞外耗氧情况测量。...

细胞耗氧率检测试剂盒

 

产品编号：HR8262

产品组成：

储存条件：

探针-20℃密封避光(避免反复冻融,防止氧化)；试剂B室温保存。有效期6个月。

细胞耗氧率检测试剂盒产品说明：

本产品是利用我公司合成的特异性氧气荧光探针R01来检测细胞外耗氧情况变化的试剂盒。可以通过简单的混合基于荧光酶标仪便捷的直接进行耗氧量测定。

R01耗氧量分析可实时测量全细胞或分离线粒体的耗氧量,是以高通量形式来评估用于代谢表征的细胞呼吸以及评估治疗对线粒体功能毒性作用的一种可靠方法。

它可以使用荧光酶标仪在标准微孔板上进行有氧代谢的简单动力学测定。随着呼吸作用的进行,溶解氧被消耗,样品中的氧气浓度降低,导致R01分析的信号增加,从而实现对耗氧量的测定。

R01是氧气敏感的荧光探针,最大激发波长为468nm,最大发射波长为603nm。其荧光通过分子碰撞与氧气反应,由O₂淬灭,在无氧条件下荧光强度更高,反之有氧条件下荧光强度变低,因此荧光信号的量与样品中细胞外O₂的量成反比,从而R01可被用于监测细胞外氧气消耗的变化。在测定中,耗氧量由荧光信号随时间的变化计算。细胞耗氧量增加,荧光信号的变化率增加；反之,耗氧量减少,荧光信号的变化率降低。

R01与O₂的这种反应是非破坏性且完全可逆的,R01无细胞毒性,是化学稳定的,惰性的,水溶性的和细胞不渗透的,不能透过完整的细胞膜。因此还可同时与糖酵解,线粒体膜电位JC-1,ROS和细胞ATP、LDH等检测的试剂结合使用,进行多参数检测。

用R01进行细胞外耗氧检测方法及其简单,不需要适用特殊的仪器设备,只需要荧光酶标仪之类的荧光读板设备即可。

细胞氧气消耗检测试剂盒可以用于直接,实时分析细胞呼吸和线粒体功能。本试剂盒可以用来测量各种全细胞（贴壁和悬浮细胞）,透化细胞,各种3D培养物,组织,小生物,球体,支架和基质等。还适用于分离的线粒体,分离的酶,细菌,酵母和霉菌等的细胞外耗氧情况测量。

以96孔细胞培养板计,本试剂盒小包装可以检测200个样本。

产品特点：

● 广泛适用于各种体外模型；不再局限于单层细胞,还能测定悬浮细胞、微生物和特定的3D培养物；

● 简单的“混合-检测”方案允许使用多种其他分析试剂盒进行多参数分析；

● 可逆转,能够观察耗氧量的瞬态和长时间变化；

● 可适配多种荧光酶标仪以及标准96孔和384孔；

● 以高通量的形式方便地测量；

● 无需等待专用设备空闲所需的实验室时间,也无需大额资金专用设备投入。

产品用途：

● 线粒体功能和细胞代谢研究；

● 测量活细胞中的线粒体活性；

● 研究各种处理对细胞耗氧量的影响；

● 研究基因修饰对细胞耗氧量的影响；

● 研究呼吸和线粒体功能；

● 探究氧含量与细胞代谢变化之间的联系；

● 直接评估药物处理的线粒体毒性。

适用样本类型：

● 细胞：贴壁细胞/悬浮细胞/透化细胞；

● 分离的线粒体；

● 3D培养物；组织；

● 分离的酶；

● 微生物：细菌/酵母/霉菌。

荧光检测模式：

● 基础模式：荧光强度测定；

● 标准模式：时间分辨荧光测量（TR-F）；

● 高级模式：荧光Lifetime calculation（FLIM,Autofluorescence Lifetime Imaging system,Dual-read Ratiometric TR-F measurement）

【注】：

● 以上取决于酶标仪的类型和仪器设置,不是所有仪器可用。

试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：

● 荧光酶标仪（须配备相应的波长过滤器和温度控制器。时间分辨荧光功能的读板机佳（如果有）） ● 离心机 ● PBS/HBSS（无酚红） ● 对照试剂（选配,非必须）：Glucose Oxidase,Antimycin A,FCCP ● 黑色透明底荧光专用培养板

细胞耗氧率检测试剂盒使用注意事项：

● 螺旋盖微量管装试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体收集至管底,避免开盖时液体洒落。

● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

● 以下操作以96孔细胞培养板为例。其他培养容器或装置请根据实际情况调整试剂用量和检测方法。各试剂等比例调整即可。O₂荧光探针终浓度25倍稀释最佳。
● R01探针的信号变化直接取决于所测量细胞类型的细胞呼吸速率,建议尽可能使用每孔高的细胞密度作为起点,并根据需要减少细胞数量。

● 并非所有细胞类型都消耗足够用于检测的氧气。

● 必须用荧光培养专用的透明底黑色培养板,减少检测时各孔之间的光互相干扰。

● 用于测定的所有仪器试剂溶液耗材均需37℃预热。

● 添加氧气封闭液时注意避免产生气泡。

● 尽可能使用多通道移液器添加试剂。

● 如果药物有红色荧光（如阿霉素等）需要换液,不含培养基和待测药物,用HBSS货PBS体系检测,在无血清无酚红环境检测。

● 建议设定FCCP处理的阳性对照样本。

关于仪器设置：

● 温度对检测有较大影响。有条件的话,务必使用配有温度控制的酶标仪。

● 常规的荧光信号强度测量,使用基于单色仪或基于过滤器的酶标仪,最佳激发波长使用450-460nm,发射波长使用586-600nm。可根据实际机器和样本选择信号最强的波长。

● 具有检测增益参数（PMT,Parameters）的通常设置为中或高。

● 使用bottom read读数和top read读数均可,基于不同的细胞模型,建议在预实验时两种读数模式均尝试下,看哪种的趋势更加明显。

关于氧气封闭液使用：

● 氧气封闭液可以用移液器吸取添加,添加时需要沿着培养板壁慢慢加入,使其顺板壁向下流到培养基表面。

● 也可以直接用滴瓶滴加,倒转预热的滴管瓶并轻轻施加压力,使封闭液足以充注瓶尖。每个孔滴两滴,使每个液滴在孔侧面顺应向下流到培养基表面。

● 使用移液器添加封闭液时,可将黄色吸头的嘴部用锋利的刀片或剪刀修剪处理。将竖直吸头离尖端3-4mm 处45°角修剪处理。

● 取下滴管瓶内嘴盖,轻轻吸取预热的氧气封闭液。避免上下吹吸形成气泡。

关于细胞培养：

● 对于贴壁细胞,在200μL培养基中的96孔板中接种细胞。在37℃的CO₂培养箱中孵育过夜。

● 对于悬浮细胞,在检测当天在100μL培养基中接种。

● 注意所需的接种密度取决于细胞类型。 我们推荐进行细胞接种密度预实验以确定最佳密度。通常从高细胞密度（通常为60,000）开始,每孔的最佳细胞数一般为：贴壁细胞每孔80,000个细胞,悬浮细胞每孔5-6×10⁵（96 孔板）。

● 检测待测样品都设置3复孔。

● 注意始终每96孔板留出至少6个孔,以免添加细胞作为空白对照和信号控制孔。

关于对照孔设置：

● 一般空白孔要设置,其它对照根据实验需要决定。

● （推荐对照设置,以下可选,非必须）：

空白对照：	保留两个或三个孔,使其不添加细胞以用作空白对照。 向每个孔中添加100μL新鲜培养基。 （不要在这些孔中添加R01氧荧光探针）
无细胞阴性对照：	使两孔或三孔没有细胞添加用作无细胞阴性对照。 加入100μL 新鲜培养基+ 4μL R01氧荧光探针。
无细胞阳性对照：	使两孔或三孔没有细胞添加用作无细胞阳性对照。 加入90μL新鲜培养基+ 10μL（1mg/mL）葡萄糖氧化酶（水溶液）+ 4μL R01氧荧光探针试剂。 如果读板器设置正确,则这些孔将显示出荧光强度/寿命的快速增加,这表明葡萄糖氧化酶活性引起的耗氧。
有细胞阴性对照：	向包含细胞的两个或三个孔中加入1μL（100μM）抗霉素A储备溶液+ 4μL R01氧荧光探针试剂。 抑制剂抗霉素A 将抑制由线粒体呼吸引起的氧气消耗。
*有细胞阳性对照：	向包含细胞的两个或三个孔中加入1μL（0.1-5 mM）FCCP储备溶液+ 4μL R01 氧荧光探针试剂。 激活剂FCCP将显著提高细胞呼吸的氧气消耗。 【注】： ● 如果使用FCCP处理,必须进行剂量测试,因为细胞对FCCP呈现钟形响应

使用方法：

1. 准备细胞模型。

【注】：

● 根据自己实验需要设计相应方案,准备待测试化合物。

● 注意设置对照孔,复孔等。

● 建议始终使用至少两个没有细胞的孔作为空白对照孔（不要在这些孔中添加R01氧荧光探针）和至少两个其他无细胞的孔作为无细胞阴性对照孔。还可以考虑设置无细胞阳性对照,如前“推荐对照”中所述。

2. 培养好的待检测细胞移除培养基,用PBS洗涤细胞。

3. 加入100μL新鲜培养基。

【注】：

● 以96孔板为例。

4. 加入4μL R01氧荧光探针,充分混匀。

5. （可选）可以在此处添加待测试化合物（通常为1-10μL）（如果需要的话）。

【注】：

● 建议将添加的化合物的量保持在较低水平,以最大程度地减少溶剂的潜在影响。

6. 每孔加入100μL氧气封闭液。

【注】：

● 建议用移液器准确吸取,也可以直接用滴瓶滴加2滴。

● 需要沿着培养板壁慢慢加入,不要伸到培养基液面下快速加入。

● 注意避免产生气泡。

● 封闭液量的微小变化（在90-110μL之间）对检测没有不利影响。

7. 然后用该细胞板进行荧光细胞外O₂消耗变化情况检测。

激发波长455-468nm,发射波长603nm。测定荧光强度,每2分钟或3分钟读取一次。

【注】：

● 荧光强度随着细胞外O₂消耗增加。

● 荧光检测需要使用荧光专用的透明底黑色培养板。

● 有些细胞模型刚开始检测的一小段时间内可能出现荧光强度下降的情况,一般10分钟左右。可以等荧光平衡后开始上升的时间点作为起点。

8. 绘制耗氧率曲线。

【注】：

● 荧光强度值经空白对照校正。

9. 计算每个样品的斜率值。

【注】：

● 注意选择每个信号曲线的线性部分,避开起始的滞后数据,避开后期的平稳期。

● 线性回归确定每孔的斜率（OCR耗氧率）。

● 计算重复孔之间的平均值。

● （选做）如果需要,可以从所有测试值中减去无细胞阴性对照样品或基于细胞的阴性对照样品获得的斜率。

结果示例：

1. 斜率曲线获得

 

 

 

 

 

 

 

 

2. 绘制剂量反应曲线

要生成剂量响应曲线,绘制计算的耗氧率（OCR）与生成如上OCR曲线的数据对应的化合物浓度的关系曲线,如下：OCR与药物浓度的关系证明抗霉素A引起对细胞呼吸的抑制反应。

 

 

 

 

 

 

 

常见问题分析：

● 耗氧率检测趋势跟预期的不一致？

检查细胞接种和移液的一致性。

增加细胞密度。

将测定体积减少到60μL。

在某些较短检测时间区间内,会出现荧光数据的波动情况,出现斜率下降或不变化,需要扩大到更长的时间范围内来分析耗氧率趋势。一般检测时间范围不少于30分钟。

温度对检测有较大影响。有条件的话,务必使用配有温度控制的酶标仪,仪器以及所有培养基和储备溶液均须使用前37℃预热。注意某些读板器的温度控制不一致,如果存在这种情况,请考虑将测定和平衡温度降低到30℃,避开外圈。

● 使用的细胞类型灵敏度不够？

可以考虑以下改善方案：

增加酶标仪的增益（PMT）设置。

在无酚红或无血清的情况下测定。

增加R01氧荧光探针的体积（至少10μL/孔）。

减少R01氧荧光探针的体积（至2μL/孔）

增加细胞密度。

将测定体积减少到60μL。

测量底部读数（如果有）。

调整TR-F焦距。

● 我无法在含有细胞的孔中检测到任何信号,或者我可以检测到信号,但斜率（速率）显得很低？

检查正确的仪器设置,设置信号优化。

增加细胞密度。

将测定体积减少到60μL。

● 开始测定时荧光强度出现下降趋势？

有些细胞模型样本刚开始测定的一小段时间内可能出现荧光强度下降的情况,一般10分钟左右,可以等荧光平衡后开始上升的时间点作为起点。

附 录

实验数据分析方法

产品说明：

细胞氧气消耗检测试剂盒是利用合成的特异性氧气荧光探针R01来检测细胞外耗氧情况变化的试剂盒。

R01是氧气敏感的荧光探针,最大激发波长为 468 nm,最大发射波长为603 nm。其荧光通过分子碰撞与氧气反应,由O₂淬灭,在无氧条件下荧光强度更高,反之有氧条件下荧光强度变低,因此荧光信号的量与样品中细胞外O₂的量成反比,从而R01可被用于监测细胞外氧气消耗的变化。在测定中,耗氧量由荧光信号随时间的变化计算。

细胞活动的代谢效应可以通过分析R01荧光信号的变化率来评估,变化率低表明有氧代谢活动减少,耗氧量减少；反之,变化率高表明有氧代谢活动增加,细胞耗氧量增加。

应用实例

一：细胞氧气消耗率（OCR）的测定

二：药物浓度与细胞耗氧率的量效关系测定

三：分离的线粒体的呼吸测定

四：耗氧率与线粒体膜电位（MMP）双重分析

五：耗氧率与细胞活性双重分析

应用实例一：

细胞氧气消耗率（OCR）的分析：

利用R01分析研究HepG2细胞的耗氧量。在用解偶联剂FCCP处理的细胞中,由于呼吸作用增加,信号变化率也随之增加。相反,用线粒体呼吸抑制剂抗霉素A处理则产生了相反的效果。由于耗氧量减少,信号变化率也降低。

这类测定可以在多种培养基中进行,可以根据需要进行灵活的实验分析设计。

材料和试剂：

● HepG2 细胞 ● FCCP ● Antimycin A ● 待测化合物 ● HBSS等

实验步骤：

1. 培养HepG2细胞

2. 药物处理细胞。

3. 测定荧光。

实验结果：

图一（A）：

用调节线粒体功能的化合物处理后的细胞的R01典型荧光信号曲线：

抗霉素A（线粒体呼吸抑制剂）处理抑制了氧消耗,因此,探针信号变化率也随之减小。使用FCCP（解偶联剂）处理时耗氧量增加,探针信号变化率也随之增加。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

细胞呼吸消耗溶解氧,降低了细胞外O₂含量,导致R01试剂荧光信号增加。增加的速率反映出了O₂消耗速率。抑制剂（Antimycin A）和药物影响电子传递链,抑制了细胞呼吸,而解偶联剂（FCCP）能促使呼吸作用达到最大速率。剂量响应曲线显示出良好的分析间重现性。

图一（B）：相对细胞耗氧率：

以上的代谢效应可以通过分析R01试剂信号的变化率来评估,变化率低表明有氧代谢活动减少。经调控耗氧率（OCR）的化合物处理后的HepG2细胞的细胞代谢通量,以相对于未经处理的对照细胞的百分比表示。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

应用实例二：

用于毒理学的R01解决方案,药物浓度与细胞耗氧率的量效关系：

药源性线粒体功能障碍与多种药物类别有关,并且研究证明其可显著引起肝脏、心脏、肾脏、肌肉和中枢神经系统毒性。

得益于微孔板形式和分析性能,R01分析为药源性线粒体影响的早期筛选以及生成剂量-响应曲线提供了一种方便的解决方案（图2）。这些研究可采用一系列相关的体外模型进行,包括原代肝细胞和hiPSC衍生的心肌细胞和肝细胞。

材料和试剂：

● 心肌细胞 ● Nifedipine ● HBSS等

实验步骤：

1. 培养心肌细胞

2. 药物处理细胞。

3. 测定荧光。

实验结果：

图二：分析药源性细胞毒性：

利用R01分析测定Nifedipine对心肌细胞心肌细胞线粒体呼吸的剂量-响应曲线。这些值由斜率OCR与对照细胞进行归一化处理得到。

 

 

 

 

 

 

 

 

应用实例三：

测量分离的线粒体的呼吸：利用R01,能更容易地测量分离的线粒体的呼吸。该分析能够在常规荧光酶标仪上进行,可基于微孔板直接进行方便、高通量的电子传递链(ETC)活性评估(图3A)。这有利于更方便地进行化合物筛选和剂量-响应分析（图3B）。

此外,利用特定的底物和抑制剂组合,可以对单个ETC复合体和相关的线粒体蛋白进行更详细的机制评估。与传统的极谱法相比,R01分析所需的样品量相对较少,每次分离可以进行更多的重复分析。低样品量需求显著增加了由单次线粒体处理可获得的数据量,尤其是在使用 384 孔板时。

材料和试剂：

● 大鼠肝脏组织 ● 线粒体分离试剂盒 ● FCCP ● 待测化合物 ● HBSS等

实验步骤：

1. 分离线粒体

2. 药物处理线粒体。

3. 测定荧光。

实验结果：

图三（A）：分析药源性细胞毒性：

使用R01分析得到的分离线粒体（大鼠肝脏）的呼吸分析结果 (A) 显示了用经典的线粒体功能调节剂处理后的抑制和解偶联作用。

 

 

 

 

 

 

 

 

图三（B）：分析药源性细胞毒性：

使用大鼠肝脏线粒体筛选一组未知药物以鉴定药源性线粒体功能障碍（药物2和6）。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

应用实例四：

线粒体功能的多参数和多重评估：

耗氧率（OCR）与线粒体膜电位（MMP）双重分析：

通过将R01分析与其他相关酶标仪兼容参数（例如,线粒体膜电位(MMP)、活性氧 (ROS) 或细胞ATP含量）的测定相结合,可以实现对细胞反应的进一步了解。这样一来,研究人员能够更好地研究各种处理或条件变化对细胞功能的影响。它还有助于将观察到的代谢干扰情境化,而无需进行平行处理或使用不同的技术平台。

在同一孔中进行R01分析信号和JC-1测定。使用Antimycin A或FCCP处理HepG2细胞。两种化合物均引起MMP降低(A),FCCP引起耗氧量的特征性增加,而Antimycin A则抑制呼吸(B)。

材料和试剂：

● HepG2细胞 ● JC-1线粒体膜电位试剂盒 ● FCCP ● Antimycin A ● HBSS等

实验步骤：

1. 培养HepG2细胞

2. 药物处理细胞。

3. 测定荧光。

实验结果：

图四（A）：线粒体膜电位（MMP）

使用 JC-1 线粒体膜电位检测FCCP 处理、Antimycin A 处理、未处理对照细胞的线粒体膜电位情况。使用FCCP 和Antimycin A处理的细胞均引起 MMP 降低。

 

 

 

 

 

 

 

图四（B）：耗氧率（OCR）

使用R01分析FCCP处理、Antimycin A处理、未处理对照细胞的OCR。

使用FCCP处理的细胞OCR升高,使用Antimycin A处理的细胞OCR降低。

 

 

 

 

 

 

 

应用实例五：

线粒体功能的多参数和多重评估：

耗氧率（OCR）与细胞活性（Calcein AM荧光法）双重分析：

利用细胞活力（Calcein AM荧光法）和线粒体呼吸（OCR）的双重测定,更好地理解

药物治疗对细胞功能的脱靶效应（图5）。

Antimycin A 处理（A）和Tamoxifen 处理（B）24 小时的 HepG2 细胞中的R01分析信号和Calcein AM双重测定。两种药物都能减弱线粒体呼吸（浅紫红色）。

Tamoxifen对细胞活力表现出显著影响,而Antimycin A处理并未显著降低细胞活力（深紫红色）。这表明,Antimycin A对呼吸的影响是由更直接的线粒体机制引起的。

材料和试剂：

● HepG2细胞 ● 细胞活性检测试剂盒 ● Tamoxifen ● Antimycin A ● HBSS等

实验步骤：

1. 培养HepG2细胞

2. 药物处理细胞。

3. 测定荧光。

实验结果：

图五（A）：抗霉素 A 处理

Antimycin A 处理的细胞OCR 明显降低（●）,细胞活力未显著降低（■）。

Antimycin A 对呼吸的影响是由直接的线粒体机制引起。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

图五（B）：Tamoxifen 处理

Tamoxifen 处理的细胞OCR 明显降低（●）,细胞活力明显降低（■）。

Tamoxifen 对呼吸的影响不是由直接的线粒体机制引起。

 

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