HR9096 线粒体耗氧率检测试剂盒

线粒体氧气消耗检测试剂盒可以用于直接，实时分析线粒体呼吸和线粒体功能。本试剂盒可以用来测量各种分离的线粒体，分离的酶，细菌，酵母和霉菌等的胞外耗氧情况测量。以96孔细胞培养板计，本试剂盒小包装可以检测200个样本。...

线粒体耗氧率检测试剂盒

 

产品编号：HR9096

产品组成：

储存条件：

探针-20℃密封避光保存；试剂B室温保存，有效期6个月。

【注】：

● 避免反复冻融；注意防止氧化；

产品简介：

线粒体氧气消耗检测试剂盒(Mitochondrial Oxygen Consumption Rate Assay Kit)是利用合成的特异性氧气荧光探针R02来检测分离线粒体耗氧情况变化的试剂盒。可以通过简单的混合基于荧光酶标仪便捷的直接进行耗氧量测定。

耗氧量分析是研究代谢的有用工具。耗氧量测量结果是细胞代谢功能，更具体而言是线粒体功能的关键性指示。通过这类指标来探究活细胞代谢，可为细胞功能以及代谢变化在疾病进展中的作用提供深入洞察。

线粒体功能对细胞代谢、存活和能量产生至关重要。线粒体呼吸受损与病理状态(如癌症、缺血性再灌注损伤和神经退行性疾病)有关。线粒体毒性也是安全相关的抗药性和药物戒断症状的常见原因。

R02耗氧量分析可以实时测量分离线粒体的耗氧量，是以高通量形式来评估用于代谢表征的细胞线粒体呼吸以及评估治疗对线粒体功能毒性作用的一种可靠方法。

它可以使用荧光酶标仪在标准微孔板上进行有氧代谢的简单动力学测定。随着呼吸作用的进行，溶解氧被消耗，样品中的氧气浓度降低，导致R02分析的信号增加，从而实现对耗氧量的测定。

是氧气敏感的荧光探针，最大激发波长为468nm，最大发射波长为603nm。其荧光通过分子碰撞与氧气反应，由O₂淬灭，在无氧条件下荧光强度更高，反之有氧条件下荧光强度变低，因此荧光信号的量与样品中线粒体外O₂的量成反比，从而R02可被用于监测线粒体氧气消耗的变化。在测定中，耗氧率由荧光信号随时间的变化计算。线粒体耗氧量增加，荧光信号的变化率增加；反之，耗氧量减少，荧光信号的变化率降低。

R02与O₂的这种反应是非破坏性且完全可逆的，R02对线粒体没有毒性，其是化学稳定的，惰性的，水溶性的和不渗透的，不能透过完整的线粒体膜。

因此还可以同时与糖酵解， 线粒体膜电位JC-1，ROS和ATP等检测的试剂结合使用，进行多参数检测。

用R02进行线粒体耗氧检测方法及其简单，不需要适用特殊的仪器设备，只需要荧光酶标仪之类的荧光读板设备即可。

R02采用可见光激发检测，相对于采用紫外光激发的检测试剂，损伤更低，对线粒体的毒害更小。结果更加准确客观。

线粒体氧气消耗检测试剂盒可以用于直接，实时分析线粒体呼吸和线粒体功能。本试剂盒可以用来测量各种分离的线粒体，分离的酶，细菌，酵母和霉菌等的胞外耗氧情况测量。

以96孔细胞培养板计，本试剂盒小包装可以检测200个样本。

线粒体耗氧率检测试剂盒产品特点：

● 广泛适用于各种体外模型；不再局限于细胞，还能测定分离的线粒体、分离的酶、微生物和特定的3D培养物；

● 简单的“混合-检测”方案允许使用多种其他分析试剂盒进行多参数分析；

● 可逆转，能够观察耗氧量的瞬态和长时间变化；

● 可适配多数荧光酶标仪以及标准96孔和384孔；

● 以高通量的形式方便地测量；

● 无需等待专用设备空闲所需的实验室时间，也无需大额资金专用设备投入。

产品用途：

● 线粒体功能和细胞代谢研究；

● 测量线粒体活性；

● 研究各种处理对细胞耗氧量的影响；

● 研究基因修饰对细胞耗氧量的影响；

● 研究呼吸和线粒体功能；

● 探究氧含量与细胞代谢变化之间的联系；

● 直接评估药物处理的线粒体毒性。

适用样本类型：

● 分离的线粒体；

● 3D培养物；组织；

● 分离的酶；

● 微生物；细菌/酵母/霉菌。

荧光检测模式：

● 基础模式：荧光强度测定；

● 标准模式：时间分辨荧光测量(TR-F)；

● 高级模式：荧光Lifetime calculation(FLIM，Autofluorescence Lifetime Imaging system，Dual-read Ratiometric TR-F measurement)

【注】：

● 以上取决于酶标仪的类型和仪器设置，不是所有仪器可用。

试剂盒以外自备试剂和仪器：

● 荧光酶标仪，须配备相应的波长过滤器和温度控制器。时间分辨荧光功能的读板机佳(如果有)。 ● 离心机 ● 移液器 ● PBS缓冲液(1×)或者HBSS(无酚红)

● 对照试剂(选配，非必须)：Glucose Oxidase，Antimycin A，FCCP

● 黑色透明底荧光专用培养板

注意事项：

● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

● 以下操作以96孔板为例。其他培养容器或装置请根据实际情况调整试剂用量和检测方法。各试剂等比例调整即可。O₂荧光探针终浓度16倍稀释最佳。

● 线粒体的提取操作对检测很重要，尽量减少对线粒体的损伤。

● R02探针的信号变化直接取决于所测量细胞类型的线粒体呼吸速率，建议尽可能使用每孔高的线粒体密度作为起点，并根据需要减少线粒体数量。

● 并非所有线粒体类型都消耗足够用于检测的氧气。

● 最好使用荧光培养专用的透明底黑色培养板。实在没有的话可以采用透明板，注意孔间隔开，减少检测时各孔之间的光互相干扰。

● 用于测定的所有仪器试剂溶液耗材均需37℃预热。

● 添加氧气封闭液时注意避免产生气泡。

● 尽可能使用多通道移液器添加试剂。

关于仪器设置：

● 温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪。

● 常规的荧光信号强度测量，使用基于单色仪或基于过滤器的酶标仪，最佳激发波长用450-460nm，发射波长用586-600nm。可根据实际机器和样本选择信号最强波长。

● 具有检测增益参数(PMT，Parameters)的通常设置为中或高。

● TR-F测量可减少非特异性背景和增加探针灵敏度。最佳delay time为约30μs，gate(integration)time 是100μs。

● 一般使用底部读数bottom read。

关于氧气封闭液使用：

● 氧气封闭液可以用移液器吸取添加，添加时需要沿着培养板壁慢慢加入，使其顺板壁向下流到培养基表面。

● 也可以直接用滴瓶滴加，倒转预热的滴管瓶并轻轻施加压力，使封闭液足以充注瓶尖。每个孔滴两滴，使每个液滴在孔侧面顺应向下流到培养基表面。

● 使用移液器添加封闭液时，可将黄色吸头的嘴部用锋利的刀片或剪刀修剪处理。将竖直吸头离尖端3-4mm处45°角修剪处理。

● 取下滴管瓶内嘴盖，轻轻吸取预热的氧气封闭液。避免上下吹吸形成气泡。

关于线粒体接种密度：

● 注意所需的线粒体接种密度取决于细胞类型和获得线粒体的方法。我们推荐进行线粒体接种密度预实验以确定最佳密度。通常从高线粒体密度(通常为80,000个细胞的线粒体，线粒体提取得率＞80%)开始，每孔的最佳线粒体数一般为：每孔提取80,000个细胞的线粒体(96孔板)。

● 检测待测样品都设置3复孔。

● 注意始终在每个96孔板上留出至少6个孔，以免添加线粒体作为空白对照和信号控制孔。

线粒体耗氧率检测试剂盒关于对照孔设置：

● 一般空白孔要设置，其它对照根据实验需要决定。

● (推荐对照设置，以下可选，非必须)：

空白对照：

保留两个或三个孔，使其不添加线粒体以用作空白对照。

向每个孔中添加100μL 新鲜培养基。

(不要在这些孔中添加R02氧荧光探针)

无线粒体阴性对照：

使两孔或三孔没有线粒体添加用作无线粒体阴性对照。

加入90μL新鲜培养基+10μL R02氧荧光探针。

无线粒体阳性对照：

使两孔或三孔没有线粒体添加用作无线粒体阳性对照。

加入90μL新鲜培养基+10μL(1mg/mL)葡萄糖氧化酶(水溶液)+10μL R02氧荧光探针试剂。

如果读板器设置正确，则这些孔将显示出荧光强度/寿命的快速增加，这表明葡萄糖氧化酶活性引起的耗氧。

有线粒体阴性对照：

向包含线粒体的两个或三个孔中加入1μL(100μM)抗霉素A储备溶液+10μL R02氧荧光探针试剂。

抑制剂抗霉素A将抑制由线粒体呼吸引起的氧气消耗。

有线粒体阳性对照：

向包含线粒体的两个或三个孔中加入1μL(0.1-5mM)FCCP储备溶液+10μL R02氧荧光探针试剂。激活剂FCCP将显著提高线粒体呼吸的氧气消耗。

【注】：

● 如果使用FCCP处理，必须进行剂量测试，因为线粒体对FCCP呈现钟形响应。

使用方法：

1. 准备线粒体模型。

【注】：

● 根据自己实验需要设计相应方案，准备待测试化合物。

● 注意设置对照孔，复孔等。

● 建议始终使用至少两个没有线粒体的孔作为空白对照孔(不要在这些孔中添加R02氧荧光探针)和至少两个其他无线粒体的孔作为无线粒体阴性对照孔。还可以考虑设置无线粒体阳性对照，如前“推荐对照”中所述。

● 线粒体的提取操作对检测很重要，尽量减少对线粒体的损伤。

2. 提取待检测线粒体，用PBS洗涤线粒体。

3. 加入100μL线粒体HBSS悬液。

【注】：

● 以96孔板为例。

4. 加入10μL R02氧荧光探针，充分混匀。

5. (选做)可以在此处添加待测试化合物(通常为1-10μL)(如果需要的话)。

【注】：

● 建议将添加的化合物的量保持在较低水平，以最大程度地减少溶剂的潜在影响。

6. 每孔加入100μL氧气封闭液。

【注】：

● 建议用移液器准确吸取，也可以直接用滴瓶滴加2滴。

● 需要沿着培养板壁慢慢加入，不要伸到培养基液面下快速加入。

● 注意避免产生气泡。

● 封闭液量的微小变化(在90-110μL之间)对检测没有不利影响。

7. 然后用该96孔板进行荧光线粒体外O₂消耗变化情况检测。

激发波长468nm，发射波长603nm。每2分钟或3分钟读取一次。

【注】：

● 荧光强度随着线粒体外O₂消耗增加。

● 荧光检测需要使用荧光专用的透明底黑色培养板。

● 最好用带时间分辨荧光功能的读板机。

8. 绘制耗氧率曲线。

【注】：

● 荧光强度值经空白对照校正。

9. 计算每个样品的斜率值。

【注】：

● 注意选择每个信号曲线的线性部分，避开起始的滞后数据，避开后期的平稳期。

● 线性回归确定每孔的斜率(OCR耗氧率)。

● 计算重复孔之间的平均值。

● (选做)如果需要，可以从所有测试值中减去无线粒体阴性对照样品或基于线粒体的阴性对照样品获得的斜率。

结果示例：

1. 斜率曲线获得

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. 绘制剂量反应曲线

要生成剂量响应曲线，绘制计算的耗氧率(OCR)与生成如上OCR曲线的数据对应的化合物浓度的关系曲线，

如下：OCR与药物浓度的关系证明抗霉素A引起对线粒体呼吸的抑制反应。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

常见问题分析：

● 耗氧率检测趋势跟预期的不一致？

检查线粒体接种和移液的一致性。

增加线粒体密度。

将测定体积减少到60微升。

在某些较短的检测时间区间内，会出现荧光数据的波动情况，出现斜率下降或不变化，需要扩大到更长的时间范围内来分析耗氧率趋势。一般检测时间范围不少于30分钟。

温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪，仪器以及所有培养基和储备溶液均须使用前37℃预热。注意某些读板器的温度控制不一致，如果存在这种情况，请考虑将测定和平衡温度降低到30℃，避开外圈。

● 使用的线粒体类型灵敏度不够？

可以考虑以下改善方案：

增加酶标仪的增益(PMT)设置。

在无酚红或无血清的情况下测定。

增加R02氧荧光探针的体积(15μL/孔)。

增加线粒体密度。

将测定体积减少到60微升。

测量底部读数(如果有)。

调整TR-F焦距。

● 我无法在含有线粒体的孔中检测到任何信号，或者我可以检测到信号，但斜率(速率)显得很低？

检查正确的仪器设置，设置信号优化。

增加线粒体密度。

将测定体积减少到60微升。

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