HR0233-50T 动物线粒体提取试剂盒
本试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的线粒体提取。最好用于新鲜样品的线粒体提取,由于冷冻样品的线粒体在冻存过程中可能被破坏,提取回收率可能大幅降低。本试剂盒提取的线粒体可以用于各种线粒体功能研究、蛋白提取等下游应用。...
适用样本:
● 组织 ● 细胞
试剂盒以外自备试剂和仪器:
● 移液器 ● 离心机 ● 振荡器 ● Dounce匀浆器 ● 涡旋混匀器 ● PBS缓冲液
注意事项:
● 旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心,将盖内壁上的液体甩至管底,避免开盖时液体洒落。
● 实验过程中的所有试剂须预冷;所有器具须放-20℃冰箱预冷。整个过程须保持样品处于低温。
● 最好使用标准Dounce匀浆器匀浆,如果没有标准Dounce匀浆器,用普通1mL玻璃匀浆器匀浆也可,但是线粒体回收率会下降。
使用方法:
细胞线粒体提取:
1、取1-2×107个细胞,在4℃,500×g条件下离心2-3 分钟,小心吸取培养基,尽可能吸干,收集细胞;
2、用冷PBS洗涤两次,每次洗涤后尽可能吸干上清。
【注】:
● 用1000×g力离心5分钟。
3、细胞沉淀中加入500μL-1mL冷的试剂A重悬,置冰上5分钟。
4、用 Dounce匀浆器匀浆30-40下,然后在4℃,500×g条件下离心5分钟。
【注】:
● 先用Dounce匀浆器的松型槌初步匀浆10-20次,再用紧型槌匀浆20-30次。
● 每上下一个来回为一次。
5、将上清吸入另一预冷的干净离心管,弃沉淀。
6、将上清在4℃,1000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀,收集上清。
7、将上清在4℃,11000×g力条件下离心15分钟。弃上清,收集沉淀。
8、在沉淀中加入400μL冷的试剂B,轻轻混匀。
9、在4℃,11000×g以上条件下离心15分钟。
10、弃上清,沉淀用线粒体保存液重悬。
【注】:
● 也可不用试剂盒中的线粒体保存液重悬。
● 根据实验需要选择合适的缓冲液重悬线粒体或直接用于下游实验。
11、即得到线粒体样品,置冰箱备用或直接用于下游实验。
组织线粒体提取:
1、取50-100mg新鲜动物组织样本,用PBS洗涤干净。
2、用手术剪刀尽可能剪碎,用冷PBS洗涤两次。
【注】:
● 用1000×g里离心5分钟。
3、沉淀中加入500μL-1mL冷的试剂A混匀,置冰上5分钟。
4、用Dounce匀浆器匀浆30-40下,然后在4℃,500×g条件下离心5分钟。
【注】:
● 先用Dounce匀浆器的松型槌初步匀浆10-20次,再用紧型槌匀浆20-30次。
● 每上下一个来回为一次。
5、将上清吸入另一预冷的干净离心管,弃沉淀。
6、将上清在4℃,1000×g力条件下离心10分钟。弃沉淀,收集上清。
7、将上清在4℃,11000×g力条件下离心15分钟。弃上清,收集沉淀。
8、在沉淀中加入400μL冷的试剂B,轻轻混匀。
9、在4℃,11000×g以上条件下离心15分钟。
10、弃上清,沉淀用线粒体保存液重悬。
【注】:
● 也可不用试剂盒中的线粒体保存液重悬。
● 根据实验需要选择合适的缓冲液重悬线粒体或直接用于下游实验。
11、即得到线粒体样品,置冰箱备用或直接用于下游实验。
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