抗体的制备技术指导
发布时间：2024-01-29浏览次数：648返回列表
抗体（antibody），是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌,（免疫球蛋白不仅仅只是抗体），被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个*特征，该外来目标被称为抗原。
一、抗体制备的基本原则：
抗体制备为重要的两个原则：适量原则和时间原则。
1.适量原则:根据抗原可获取的难易程度和实际实验抗体需求量来决定制备抗体的量，小鼠一个免疫周期只要200-400ug抗原，一只兔子至少要2mg，而往往高纯度抗原获取的成本都比较高。对于科研来说，能选择小动物就不要选择大动物，小动物的抗体产量足以满足需求；鉴于动物本身个体的差异性，免疫一只兔子的抗原可以免疫4-5只小鼠，这样可以有效避免动物个体差异或动物意外死亡所造的时间成本浪费。
普通的大分子蛋白，通过分子克隆构建载体并在大肠杆菌中进行诱导表达获得重组蛋白，纯化鉴定后可直接作为免疫原。
小分子蛋白或化合物等分子量小，需要偶联载体对该分子进行改造才能使其成为具有免疫原性的抗原，常见偶联载体如BSA、OVA、HAS等。
2. 免疫动物
常用于制备抗血清的动物有豚鼠、家兔、鸡、大小鼠等，大量生产时需要用到狗、绵羊、山羊等。
3. 免疫血清的收集
一般家兔、绵羊、山羊可采用静动脉采血，家兔、豚鼠、大鼠、鸡可采用心脏采血，家兔、山羊、绵羊可采用静脉采血。
4. 免疫血清的纯化与鉴定
得到的抗血清需要进一步的纯化，利用偶联了抗原的亲和柱进行层析，具有高效，特异性强，纯度高的特定。接着要鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及特异性。
5. 免疫血清的保存
建议将抗体分装后进行保存。抗体一般比较稳定，在-80℃ ～-20 ℃可以保存约5年而不会影响效价，而真空干燥保存时间可以久。保存前需经除菌并添加防腐剂。
抗体制备出来之后,需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗,既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清,而通常经过免疫制备的抗体大多数是IgG的各种亚型,以及少数是IgM,二者电泳条带分步大致如下:
三、抗体操作注意事项:
每次试验前应列出详细试验计划，其中包含试验意图、拟用方法、所用一抗和二抗的品种和效价、预施行的操作流程计划以及预期试验结果等。试验分组编号用玻璃笔标记在玻片上，对每一抗体均应配以阳性和阴性对照。关于抗体的操作过程要素：
1．抗体分装购人的浓缩型抗体，为防止重复冻融而失效，一般需要分装在多个安瓿中，依据需要量，每安瓿含10一20rA。除留一支现用，其余应立即放置低温冰箱内贮存(-20℃以下)。用时取一支。以免长期保存在4℃冰箱内失效。
2．无菌与消毒保持使用中的抗体无菌是困难的，但是与抗体接触的东西如滴管、吸管、试管、安瓿以及加样器等通过消毒，尽量削减污染的时机．不然抗体极易污染细菌与真菌，然后敏捷发生浑浊沉积而失效。
3．抗体稀释一般按其作业浓度稀释，如1：100、1：1000等，然后用旋涡器混匀液体。剩余的抗体可保存在斗℃冰箱内．尽量在1—2个月内用完，而不 要放在0℃以下。不然抗体会很快结冰，重复冻融可使抗体效价急剧下降。关于抗体的稀释液，在夏天温度很高时，参加少许防腐剂如叠氮钠或柳硫汞等，以免在切片上效果时间超过10小时而生真菌。
一、抗体制备的基本原则：
抗体制备为重要的两个原则：适量原则和时间原则。
1.适量原则:根据抗原可获取的难易程度和实际实验抗体需求量来决定制备抗体的量，小鼠一个免疫周期只要200-400ug抗原，一只兔子至少要2mg，而往往高纯度抗原获取的成本都比较高。对于科研来说，能选择小动物就不要选择大动物，小动物的抗体产量足以满足需求；鉴于动物本身个体的差异性，免疫一只兔子的抗原可以免疫4-5只小鼠，这样可以有效避免动物个体差异或动物意外死亡所造的时间成本浪费。
2.时间原则:主要是为了解决抗体需求急迫性问题，解决实验应急问题（毕业论文或者文章修回补充数据或实验设计方案变等应急问题），对于免疫原性较好、纯度较高的抗原，可以使用抗体快速制备方案；目前，商业化抗体制备公司推出快速抗体制备服务，主要依赖于水溶性快速佐剂。
二、抗体的制备过程：
1. 免疫原的制备普通的大分子蛋白，通过分子克隆构建载体并在大肠杆菌中进行诱导表达获得重组蛋白，纯化鉴定后可直接作为免疫原。
小分子蛋白或化合物等分子量小，需要偶联载体对该分子进行改造才能使其成为具有免疫原性的抗原，常见偶联载体如BSA、OVA、HAS等。
2. 免疫动物
常用于制备抗血清的动物有豚鼠、家兔、鸡、大小鼠等，大量生产时需要用到狗、绵羊、山羊等。
3. 免疫血清的收集
一般家兔、绵羊、山羊可采用静动脉采血，家兔、豚鼠、大鼠、鸡可采用心脏采血，家兔、山羊、绵羊可采用静脉采血。
4. 免疫血清的纯化与鉴定
得到的抗血清需要进一步的纯化，利用偶联了抗原的亲和柱进行层析，具有高效，特异性强，纯度高的特定。接着要鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及特异性。
5. 免疫血清的保存
建议将抗体分装后进行保存。抗体一般比较稳定，在-80℃ ～-20 ℃可以保存约5年而不会影响效价，而真空干燥保存时间可以久。保存前需经除菌并添加防腐剂。
抗体制备出来之后,需要进一步纯化得到纯的多抗或单抗,既有利于保存也有利于排除杂蛋白对结果的影响。常规用于纯化的材料是腹水和细胞培养上清,而通常经过免疫制备的抗体大多数是IgG的各种亚型,以及少数是IgM,二者电泳条带分步大致如下:
三、抗体操作注意事项:
每次试验前应列出详细试验计划，其中包含试验意图、拟用方法、所用一抗和二抗的品种和效价、预施行的操作流程计划以及预期试验结果等。试验分组编号用玻璃笔标记在玻片上，对每一抗体均应配以阳性和阴性对照。关于抗体的操作过程要素：
1．抗体分装购人的浓缩型抗体，为防止重复冻融而失效，一般需要分装在多个安瓿中，依据需要量，每安瓿含10一20rA。除留一支现用，其余应立即放置低温冰箱内贮存(-20℃以下)。用时取一支。以免长期保存在4℃冰箱内失效。
2．无菌与消毒保持使用中的抗体无菌是困难的，但是与抗体接触的东西如滴管、吸管、试管、安瓿以及加样器等通过消毒，尽量削减污染的时机．不然抗体极易污染细菌与真菌，然后敏捷发生浑浊沉积而失效。
3．抗体稀释一般按其作业浓度稀释，如1：100、1：1000等，然后用旋涡器混匀液体。剩余的抗体可保存在斗℃冰箱内．尽量在1—2个月内用完，而不 要放在0℃以下。不然抗体会很快结冰，重复冻融可使抗体效价急剧下降。关于抗体的稀释液，在夏天温度很高时，参加少许防腐剂如叠氮钠或柳硫汞等，以免在切片上效果时间超过10小时而生真菌。
